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離心機在休止細胞反應(yīng)實驗中的運用

更新時間:2024-02-20 00:00:00瀏覽:2902次

  離心機是利用離心力,分離液體與固體顆粒或液體與液體的混合物中各組分的機械。離心機主要用于將懸浮液中的固體顆粒與液體分開,或?qū)⑷闈嵋褐袃煞N密度不同,又互不相溶的液體分開(例如從牛奶中分離出奶油);它也可用于排除濕固體中的液體,例如用洗衣機甩干濕衣服;特殊的超速管式分離機還可分離不同密度的氣體混合物;利用不同密度或粒度的固體顆粒在液體中沉降速度不同的特點,有的沉降離心機還可對固體顆粒按密度或粒度進行分級。離心機就是利用離心力使得需要分離的不同物料得到加速分離的機器。離心機應(yīng)用于化工、石油、食品、制藥、選礦、煤炭、水處理和船舶等部門。過濾式離心機的主要原理是通過高速運轉(zhuǎn)的離心轉(zhuǎn)鼓產(chǎn)生的離心力(配合適當?shù)臑V材),將固液混合液中的液相加速甩出轉(zhuǎn)鼓,而將固相留在轉(zhuǎn)鼓內(nèi),達到分離固體和液體的效果,或者俗稱脫水的效果。
  離心機在休止細胞反應(yīng)實驗中的運用:
  休止細胞反應(yīng)實驗的順利進行需要用到離心機。
  因為在細胞制備階段細菌收集過程中離心分離提取細胞。
  休止細胞又稱靜息細胞,把培養(yǎng)液中各種營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子洗去后懸浮在生理鹽水中培養(yǎng)一段時間,以消耗內(nèi)源營養(yǎng)物質(zhì),呈饑餓狀態(tài)的細胞,在研究微生物的生理生化及新陳代謝中有廣泛的應(yīng)用。它的主要特性就是細胞雖然處于休眠狀態(tài),不進行生長繁殖,但仍含有各種酶系,具有氧化和發(fā)酵能力,在適宜條件下可再恢復(fù)生長。另外休止細胞反應(yīng)專一性強,可以提高底物轉(zhuǎn)化率,不易染雜菌,可以減少產(chǎn)物對菌體生長及酶合成的抑制。
  休止細胞的制備:
  (1)菌株的活化
  用接種環(huán)將實驗所需的E. coli CVCC 249接種到已滅菌的固體斜面培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18—24 h。
  (2)菌株的獲得
  用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上刮取適量菌轉(zhuǎn)接至液體三角瓶中,恒溫振蕩培養(yǎng)箱37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD > 1.(大約1.4左右)。
  (3)細菌的收集
  將培養(yǎng)好的細胞菌液放入離心管中,離心機4500 rpm 離心收集細胞,棄去上清培養(yǎng)液,用生理鹽水洗滌,洗去培養(yǎng)液,之后離心機4500 rpm離心收集細胞,重復(fù)洗滌三次至上清液透明,棄去上清液。
  (4)菌懸液的制備
  將離心后的細胞用pH 為7.0 的磷酸緩沖液定量至25 mL,吹懸混勻,為以后實驗使用。
  (5)休止細胞的制備
  菌懸液放置在4 ℃條件下放置72 h 后,在37 ℃培養(yǎng)4—8 h,休止細胞制備完成,放在4 ℃冰箱中備用。
  脫氫酶活性的測定:
  (1) 在5 mL的離心管中加入1 mL反應(yīng)底物,并根據(jù)底物設(shè)置不同的濃度(同一濃度不同底物對細胞脫氫酶活性影響,如表1所示。不同稀釋度的各種底物對細菌脫氫酶降活性影響,我們做了三種底物的實驗,分別是乙酸鈉,琥珀酸鈉和檸檬酸鈉,如表2,表3和表4所示)。
  (2) 加入制備的休止細胞0.4 mL,用等體積的5%甲醛處理30 min滅活的細胞懸液作為對照。在加入細胞之前一定注意將休止細胞搖勻后再加。
  (3) 加入MTT 40 μL ,震蕩搖勻,此時的溶液應(yīng)呈黃色,恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃避光保溫2 h。
  (4) 加入二甲基亞砜1.3 mL,震蕩混勻后,37 ℃保溫30min ,此時溶液呈深藍紫色。
  (5) 加入PBS (pH 7.0)1.5 mL,振蕩混勻。
  (6) 722分光光度計測510 nm的OD ,每個樣品濃度至少要進行三次實驗,變異系數(shù)(coefficient of variation ,CV) 小于5%。
  酶活性是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。任何一個酶都有催化一定底物進行特定反應(yīng)的能力,但是酶的催化能力的測定實際上只能通過測定酶催化反應(yīng)速度來實現(xiàn)。酶催化反應(yīng)速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。而酶促反應(yīng)速度可用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。另外,在研究酶促反應(yīng)時,底物一般是過量的,因此一般測定產(chǎn)物的增加量較合適些。由于酶催化反應(yīng)速度受溫度、pH、離子強度及底物等諸多因素的影響,我們所謂的酶活性都是只在特定的系統(tǒng)和條件下測到的反應(yīng)速度,因此在測定酶活性時,一定要注明這些特定的條件。即使同樣的酶,甚至用同樣的測定方法和同樣的單位定義,由于條件稍有不同,也會使測到的酶活性難以比較。因此,要比較各篇文獻報道或者不同牌號制劑的某種酶活性時,必須注意它們的單位定義和測定系統(tǒng)及條件,千萬不能盲目比較。
  與酶活性相關(guān)的另一個概念是“比活”,食指單位重量的蛋白質(zhì)中所含的某種酶的催化活性,是純度量度,單位為u/mg。比活越高則酶越純。

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